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    空間轉錄組分析+單細胞分選與分離

     “空間轉錄組技術”被Nature Methods雜志評為2020年年度技術。這不是一個新的概念,這是一項緊跟著高通量單細胞轉錄組技術發展起來的前沿技術。當我們討論基因表達模式的時候,我們往往會關注兩個維度:空間維度 (temporal) 和時間維度(spatial)。

    目前研究空間轉錄組的技術非常多(見下圖),概況起來有4種解析“空間性轉錄組”的策略(如封面圖):

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    第一種方法,根據單細胞轉錄組數據并結合marker gene的原位雜交實驗數據,利用計算機來模擬重構組織的空間形態。例如Satija 和他同事提出的Seurat,這是一個在單細胞數據分析中廣泛用到的R包,我們可以利用scRNA-seq數據,結合FISH數據提供的marker gene位置信息,繪制出marker gene在正在組織區域的表達強度分布,最終每個單細胞通過marker gene表達譜(expression profiles)和強度分布(expression densities)而被定位還原組織中的特定位置;

    第二種方法,即結合激光顯微切割+測序(LCM-seq)。這種技術對儀器和實驗人員的操作要求較高,而且獲取的通量也比較低,例如Casasent和他的同事開發了topographic single cell sequencing (TSCS)技術來比較單個細胞基因組結構差異。具體是組織制片侯,用H&E染色,這樣在顯微鏡下就可以識別單個細胞核了,LCM可以以此來捕獲單個細胞了,雖然繁瑣通量低,但是仍然可以獲得單個細胞轉錄組和基因組信息;

    第三種策略,就是基于高分辨圖像的原位轉錄組測序(Image-Based In Situ Transcriptomics)。代表性的是single-molecule FISH(smFISH),這是是空間組技術“基于雜交方法的開端”。最初用FISH僅同時在亞細胞學水平定性定量檢測分析3-4mRNA轉錄本。顯然,不能滿足對檢測通量的期望,隨后多通道的multiplexed smFISH開始發展,例如Expansion FISH (ExFISH)可以檢測到8個基因,ouroboros single-molecule FISH (osmFISH) 可以檢測到33個基因。在2020年,2個研究小組,通過對單細胞每個mRNA打標簽(barcoding)的技術,進一步提高了通量。其一是Sequential FISH (seqFISH),通過多輪雜交檢測單個細胞中barcoded mRNA,這樣在單個固定的細胞中可以檢測到>10,000個基因。

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    科學家們致力于捕獲陣列中的單個細胞信息。瑞典皇家理工學院(KTH)說,這個方法的分辨率可以達到100 微米,即10個細胞。該技術面臨著許多挑戰,mRNA可能朝多方向擴散,會造成不準確的空間數據或混合表達模式的風險。

     

    其二是哈佛大學化學和物理雙料正教授莊小威(她領導的實驗室,發明了STORM,Stochastic optical reconstruction microscopy,STORM PALM,Photoactivated localization microscopy,同時首創了基于單分子的超高分辨率成像方法。)發明的MERFISH(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)。首先把細胞里面的每一種 RNA分子 確定一個二進制的標碼,然后把它做標記,標記就能顯示它的二進制標碼。在第一個回合讀的過程中,我們只標記那些 RNA 二進位第一位標碼是 1 的,而第二個回合我們只需要讀那些第二位標碼是 1 的,這樣依次下去。讀到 N 位以后,每個細胞里面有很多點,每一個點代表的都是 RNA 分子。這樣就變成一個很簡單的數學問題,如果讀了 N 位以后,你能夠區分 2 N 次方種不同的 RNA。

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    (引用自https://www.sohu.com/a/153208242_688647

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    第四種策略,就是“基于空間條形碼(spatial barcodes)的空間轉錄組技術。2017年,10X公司收購了“空間轉錄組“公司,并且將這項技術進行了商業化。接下來我來簡單介紹一下這個10X Genomics Visium產品的工作流程。

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    如上圖,一張 玻片上對應的4個捕獲區域可以構建4個空間文庫,單個捕獲區域大小為6.5 mm × 6.5 mm,約5,000 spots,單個 spot 直徑為55 μm, spot spot 中心之間的距離為100 μm,每個 spot 含有獨一無二的條形碼(spatial barcode)來標記空間位置信息,且連接著 UMI polydT)來捕獲靶區域內的 RNA,實現反轉錄,擴增,和建庫測序一系列步驟。

     

    總結說來,正如瑞典皇家理工學院(KTH)生命科學實驗室的Joakim Lundeberg及其同事指出,空間組技術可以分為兩類,

    一類是通過光學顯微直接揭示組織的基因表達;

    另一類是涉及原位雜交、原位測序、原位捕獲并通過計算機分析從而重構空間數據的技術;

    空間分析尚無法提供所有單個細胞范圍的轉錄組信息,但該領域正朝著單個細胞的方向快速發展??臻g轉錄組學是單細胞scRNA-seq后的下一波熱潮,這對人類疾病的研究特別有用,因為人類疾病通常始于單細胞,并在時空上的擴散。

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    備注:全文信息來源,見https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167779920301402

    https://science.sciencemag.org/content/348/6233/aaa6090




    單細胞分選與分離(FACS細胞流式分選/半自動手動挑選)

    流式細胞分選技術( fluorescence activated cell sorting,FACS)的應用非常廣泛, FACS 可以高通量、高效的將目標單細胞樣本回收到 96 孔板或 384 孔板中,與高通量、標準化實驗操作兼容。如果與高通量、標準化實驗操作兼容。

    缺點是 FACS 對細胞有一定損傷,對 起始 細胞數量有一定要求,細胞數量較少的細胞亞群或珍貴樣本不適合使用 FACS 進行單細胞回收。例如CTC細胞,我們另有合作伙伴的專利技術解決。

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    王卓等(2021)單細胞基因組測序技術新進展及其在生物醫學中的應用[J]. 遺傳, doi: 10.16288/j.yczz.20-363.


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